Jumat, 27 Februari 2015

Metode Penghitungan Sel Mikroorganisme


Metode Penghitungan Sel Mikroorganisme
  1. Secara tidak langsung, yaitu menghitung jumlah sel mikroorganisme dengan metode tertentu tanpa menghitung jumlah selnya. contoh;Total Plate Count (metode hitungan cawan) dengan mengikuti aturan Standard Plate Count (SPC)
  2. Secara langsung, yaitu menghitung jumlah sel mikroorganisme dengan menggunakan alat  bantu, contohnya dengan menggunakan alat Haemocytometer.
Penghitungan jumlah sel mikroorgansime dengan metode Total Plate Count
  • Prinsip dari Plate Count (metode hitung cawan) adalah jika sel mikroorganisme yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.
  • Rumus menghitung jumlah mikroorgasnisme adalah:  Jumlah mikroorganisme= jumlah koloni X 1/faktor pengenceran 
Penghitungan jumlah sel mikroorgansime  dengan metode Total Plate Count Sumber: Pelczar, M. J., Chan. E. C. S. (1988)
  1. Disiapkan 8 tabung reaksi yang masing-masing diisi dengan 9 mL larutan NaCl 0,85%
  2. 1 gram sampel dilarutkan dalam  9 ml  larutan NaClm 0.85% , dan akan diperoleh suspensi dengan tingkat pengenceran 10 -1 , ambil 1 mL suspensi pekat masukkan ke dalam tabung reaksi ke-1 lalu dikocok sehingga diperoleh suspensi dengan tingkat pengenceran 10-1.  Dari tabung ke-1 ambil 1 mL lalu masukkan ke dalam tabung reaksi ke-2, lalu kocok lagi sehingga diperoleh suspensi dengan tingkat pengenceran 10-2 , demikian seterusnya sehingga diperoleh suspensi sampai tingkat pengenceran 10-8
  3. Lalu dari seluruh tingkat pengenceran diambil 1 mL, selanjutnya ditanam di media PDA  secara duplo dengan metode Pour plate , atau 0.5 mL dengan metode Spread plate.  Penanaman bisa dilakukan secara simplo atau duplo
  4. Setelah merata diinkubasikan di suhu ruang selama 7 hari.
  5. Setelah inkubasi selesai, baru bisa dihitung jumlah koloninya
 Cara mengultur (menanam sel mikroorganisme) bisa dilakukan dengan 2 cara:
  1. Spread plate: adalah teknik penanaman yang didasarkan pada penyebaran sel pada permukaan media agar yang sudah memadat
1)      0,1 mL sampel dipipet pada permukaan media agar yang sudah memadat, ratakan sampel dengan menggunakan batang gelas melengkung yang steril, telah dicelup alkohol 96% dan dibakar
2)      Penggunaan 0,1 ml merupakan volume yang tepat untuk disebarkan diatas permukaan agar dan cukup mudah mengering sehingga tidak menggenangi permukaan agar
2.   Pour Plate: adalah teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroorganisme dalam media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata baik di permukaan agar atau di dalam agar.
1)      Volume yang dipakai pada umumnya adalah 1 mL
2)      1 mL suspensi dituangkan ke dalam media agar steril yang masih hangat kuku, lalu diratakan dengan menggerakan cawan secara berputar membentuk angka 8, dan biarkan media agar memadat
3)      Cawan petri diinkubasikan selama 7 hari
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut:
  1. Cawan yang dihitung atau dipilih adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30-300 koloni
  2. Satu koloni dihitung 1 koloni.
  3. Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
  4. Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
  5. Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.
  6. Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung
  7. Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.
Kelemahannya:
1.       Jumlah sel yang terhitung adalah sel yang hidup, tetapi hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel bisa tumbuh saling berdekatan dan bergabung membentuk satu koloni
2.       Memerlukan waktu yang cukup lama untuk mempersiapkan bahan dan alat , serta waktu inkubasi relatif lama sampai koloni dapat dihitung 

Data-data yang dilaporkan mengikuti aturan Standard Plate Count (SPC) sebagai berikut: 
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua di belakang koma dan jika angka yang ketiga sama atau lebih besar dari 5, berlaku pembulatan ke atas sebanyak satu angka
Jumlah koloni per pengenceran
Standard Plate Count
10 -4
10 -5
10 -6
234
28
1
2,3 x 10 6
700
125
10
1,3 x 10 7
Tbud
tbud
197
2,0 x 10
2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan angka kurang dari 30 koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang dhitung.  Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
Jumlah koloni per pengenceran
Standard Plate Count
10 -4 
10 -5 
10 -6 
16
1
0
< 3,0 x 10 5 
(1,6 x 10 5 ) 

3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih dari dari 300 koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran tertinggi yang dhitung.
Jumlah koloni per pengenceran
Standard Plate Count
10 -4
10 -5
10 -6
Tbud
tbud
355
    > 3,0 x 10 8
(3,6 x 10 8 )
Tbud
455
320
> 3,0 x 10 8
(3,2 x 10 8 )

4. Jika digunakan satu cawan per pengenceran (simplo) dan dua cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan sejumlah koloni antara 30-300 dan perbandingan antara hasil  tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut ≤ 2, tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya 
5. Jika hasil perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah > 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil
Jumlah koloni per pengenceran
Standard Plate Count
10 -4
10 -5
10 -6
293
41
4
3,5 x 10 6
140
32
2
1.4 x 10 6

6. Jika digunakan 2 cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu, meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat diantara 30-300 koloni.

MENGHITUNG JUMLAH SEL MIKROORGANISME  SECARA LANGSUNG DENGAN HAEMOSITOMETER
Kelemahannya:
1.       Di bawah mkroskop, sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dengan sel hidup, oleh karena itu keduanya akan bisa terhitung
2.       Sel-sel yang ukurannya sangat kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, sehingga kadang-kadang tidak terlihat dan tidak terhitung
3.       Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel bisa berdekatan dan bergabung membentuk satu koloni

Ø  Di dalam mikroskop akan terlihat ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar. Satu kotak besar di tengah memiliki luas 1 mm², dan dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan luas masing-masing 0,04 mm². Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil dengan luas masing-masing 0,0025 mm² . Dengan demikian satu kotak besar di tengah tersebut berisi 400 kotak  persegi (25 kotak sedang x 16 kotak kecil = 400 kotak persegi).  Tebal ruang hitung adalah 0,1 mm
Ø  Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

Cara menghitung sel dalam ruang hitung Haemositometer:

1.       Jumlah sel dihitung dalam ruang hitung pada hemasitometer yang ditutup kaca objek, dengan bantuan mikroskop. 
2.       Suspensi diteteskan dengan pipet sebanyak 0,5 mL, sehingga mengalir ke bawah kaca objek dan mengisi ruang hitung.
3.       Jumlah sel dihitung dalam 5 kotak sedang dalam satu kotak besar di tengah, yaitu pojok kanan dan kiri atas, pojok kanan dan kiri bawah dan tengah (5 kotak sedang x 16 kotak kecil = 80 kotak persegi kecil)
4.       Jumlah sel dalam setiap kotak kecil dihitung sesuai dengan aturan yang sudah ditetapkan
5.       Jumlah sel dalam setiap kotak persegi kecil harus mengandung maksimal 10 sel. Bila pada saat pengamatan diperoleh jumlah sel lebih besar dari 10 sel dalam setiap persegi kecil, maka perlu dilakukan pengenceran.
6.       Pengenceran diperhitungkan dalam rumus tertentu.

Prosedur Pengenceran:
Ø  Sebanyak 0,5 mL suspensi hasil pengenceran dimasukkan ke dalam
Haemasitometer, lalu lakukan penghitungan jumlah sel dalam 5 kotak  sedangdalam 1 kotak besar di tengah
Ø  Penghitungan dilakukan secara duplo
Ø  Jumlah spora dalam 0,5 mL dalam 5 kotak sedang dihitung dengan rumus:
                      S    
S= kerapatan spora /mL
Ʃn= n1+n2+n3+n4+n5 dimana:
n1 = rata-rata jumlah spora pada 16 kotak kecil pada   kotak sedang 1


Aturan penghitungan sel
1.       Karena letak mikroorganisme hidup tidak teratur, maka dalam menghitung dibuat kesepakatan agar sel yang terletak pada garis tidak dihitung dua kali.
2.       Sel-sel yang terletak pada garis sebelah kanan dan bawah tidak termasuk dalam persegi kecil yang sedang dihitung selnya. Contoh pada persegi nomor 1 jumlah selnya adalah 6.
3.       Sel-sel yang terletak pada garis sebelah kiri dan atas termasuk dalam persegi kecil yang sedang dihitung selnya. Contoh pada persegi nomor 2 jumlah selnya adalah 3, pada persegi nomor 6 jumlah selnya 5.
Add caption
Ruang hitung dalam 1 kotak kecil = 16 kotak