Metode Penghitungan Sel Mikroorganisme
- Secara tidak langsung, yaitu menghitung jumlah sel mikroorganisme dengan metode tertentu tanpa menghitung jumlah selnya. contoh;Total Plate Count (metode hitungan cawan) dengan mengikuti aturan Standard Plate Count (SPC)
- Secara langsung, yaitu menghitung jumlah sel mikroorganisme dengan menggunakan alat bantu, contohnya dengan menggunakan alat Haemocytometer.
Penghitungan
jumlah sel mikroorgansime dengan metode Total Plate Count
- Prinsip dari Plate Count (metode hitung cawan) adalah jika sel mikroorganisme yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.
- Rumus menghitung jumlah mikroorgasnisme adalah: Jumlah mikroorganisme= jumlah koloni X 1/faktor pengenceran
Penghitungan
jumlah sel mikroorgansime dengan metode Total Plate Count Sumber:
Pelczar, M. J., Chan. E. C. S. (1988)
- Disiapkan 8 tabung reaksi yang masing-masing diisi dengan 9 mL larutan NaCl 0,85%
- 1 gram sampel dilarutkan dalam 9 ml larutan NaClm 0.85% , dan akan diperoleh suspensi dengan tingkat pengenceran 10 -1 , ambil 1 mL suspensi pekat masukkan ke dalam tabung reaksi ke-1 lalu dikocok sehingga diperoleh suspensi dengan tingkat pengenceran 10-1. Dari tabung ke-1 ambil 1 mL lalu masukkan ke dalam tabung reaksi ke-2, lalu kocok lagi sehingga diperoleh suspensi dengan tingkat pengenceran 10-2 , demikian seterusnya sehingga diperoleh suspensi sampai tingkat pengenceran 10-8
- Lalu dari seluruh tingkat pengenceran diambil 1 mL, selanjutnya ditanam di media PDA secara duplo dengan metode Pour plate , atau 0.5 mL dengan metode Spread plate. Penanaman bisa dilakukan secara simplo atau duplo
- Setelah merata diinkubasikan di suhu ruang selama 7 hari.
- Setelah inkubasi selesai, baru bisa dihitung jumlah koloninya
Cara mengultur (menanam sel mikroorganisme) bisa dilakukan dengan 2 cara:
- Spread plate: adalah teknik penanaman yang didasarkan pada penyebaran sel pada permukaan media agar yang sudah memadat
1)
0,1 mL sampel dipipet pada permukaan media
agar yang sudah memadat, ratakan
sampel dengan menggunakan
batang gelas melengkung yang steril, telah dicelup alkohol 96% dan dibakar
2)
Penggunaan 0,1 ml merupakan volume yang
tepat untuk disebarkan diatas permukaan agar dan cukup mudah mengering sehingga
tidak menggenangi permukaan agar
2. Pour Plate: adalah teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroorganisme dalam media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata baik di permukaan agar atau di dalam agar.
2. Pour Plate: adalah teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroorganisme dalam media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata baik di permukaan agar atau di dalam agar.
1)
Volume
yang dipakai pada umumnya adalah 1 mL
2)
1
mL suspensi dituangkan
ke dalam media agar steril yang masih hangat kuku, lalu diratakan dengan menggerakan cawan secara berputar membentuk angka
8, dan biarkan media agar memadat
3)
Cawan
petri diinkubasikan
selama 7 hari
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai
berikut:
- Cawan yang dihitung atau dipilih adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30-300 koloni
- Satu koloni dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
- Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.
- Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung
- Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.
Kelemahannya:
1. Jumlah sel yang terhitung adalah sel yang
hidup, tetapi hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang
sebenarnya, karena beberapa sel bisa tumbuh saling berdekatan dan bergabung membentuk satu koloni
2. Memerlukan
waktu yang cukup lama untuk
mempersiapkan bahan dan alat , serta waktu
inkubasi relatif lama sampai koloni
dapat dihitung
Data-data yang dilaporkan mengikuti aturan Standard Plate Count (SPC) sebagai berikut:
1. Hasil
yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama di depan
koma dan angka kedua di belakang koma dan jika angka yang ketiga sama atau
lebih besar dari 5, berlaku pembulatan ke atas sebanyak satu angka
Jumlah koloni per pengenceran
|
Standard Plate Count
|
||
10 -4
|
10 -5
|
10 -6
|
|
234
|
28
|
1
|
2,3 x 10 6
|
700
|
125
|
10
|
1,3 x 10 7
|
Tbud
|
tbud
|
197
|
2,0 x 10
|
2. Jika
semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan angka kurang dari 30
koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang
dhitung. Hasilnya dilaporkan sebagai
kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang
sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
Jumlah koloni per pengenceran
|
Standard Plate Count
|
||
10 -4
|
10 -5
|
10 -6
|
|
16
|
1
|
0
|
< 3,0 x 10 5
(1,6 x 10 5 )
|
3. Jika
semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih dari dari 300
koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran tertinggi yang
dhitung.
Jumlah koloni per pengenceran
|
Standard Plate Count
|
||
10 -4
|
10 -5
|
10 -6
|
|
Tbud
|
tbud
|
355
|
> 3,0 x 10 8
(3,6 x 10 8
)
|
Tbud
|
455
|
320
|
> 3,0 x 10 8
(3,2 x 10 8 )
|
4. Jika
digunakan satu cawan per
pengenceran (simplo) dan dua cawan dari dua tingkat pengenceran
menghasilkan sejumlah koloni antara 30-300 dan perbandingan antara hasil
tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut ≤ 2, tentukan rata-rata
dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya
5. Jika
hasil perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah > 2, yang
dilaporkan hanya hasil yang terkecil
Jumlah koloni
per pengenceran
|
Standard Plate Count
|
||
10 -4
|
10 -5
|
10 -6
|
|
293
|
41
|
4
|
3,5 x 10 6
|
140
|
32
|
2
|
1.4 x 10 6
|
6. Jika
digunakan 2 cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari
kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu, meskipun salah satu dari
cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat diantara 30-300 koloni.
MENGHITUNG JUMLAH SEL MIKROORGANISME SECARA LANGSUNG DENGAN HAEMOSITOMETER
MENGHITUNG JUMLAH SEL MIKROORGANISME SECARA LANGSUNG DENGAN HAEMOSITOMETER
Kelemahannya:
1. Di bawah mkroskop, sel-sel yang
telah mati tidak dapat dibedakan dengan sel hidup, oleh karena itu keduanya
akan bisa terhitung
2. Sel-sel
yang ukurannya sangat kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, sehingga
kadang-kadang tidak terlihat dan tidak terhitung
3. Hasil
perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel
bisa berdekatan dan bergabung membentuk satu koloni
Ø Di
dalam mikroskop akan terlihat ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar. Satu
kotak besar di tengah memiliki luas 1 mm², dan dibagi menjadi 25 kotak sedang
dengan luas masing-masing 0,04 mm². Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16
kotak kecil dengan luas masing-masing 0,0025 mm² . Dengan demikian satu kotak
besar di tengah tersebut berisi 400 kotak
persegi (25 kotak sedang x 16 kotak kecil = 400 kotak persegi). Tebal ruang hitung adalah 0,1 mm
Ø Sel
bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga
jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.
Cara menghitung sel dalam ruang hitung
Haemositometer:
1. Jumlah
sel dihitung dalam ruang hitung pada hemasitometer yang ditutup kaca objek,
dengan bantuan mikroskop.
2. Suspensi
diteteskan dengan pipet sebanyak 0,5 mL, sehingga mengalir ke bawah kaca objek
dan mengisi ruang hitung.
3. Jumlah
sel dihitung dalam 5 kotak sedang dalam satu kotak besar di tengah, yaitu pojok
kanan dan kiri atas, pojok kanan dan kiri bawah dan tengah (5 kotak sedang x 16
kotak kecil = 80 kotak persegi kecil)
4. Jumlah
sel dalam setiap kotak kecil dihitung sesuai dengan aturan yang sudah ditetapkan
5. Jumlah
sel dalam setiap kotak persegi kecil harus mengandung maksimal 10 sel. Bila pada saat
pengamatan diperoleh jumlah sel lebih besar dari 10 sel dalam setiap persegi
kecil, maka perlu dilakukan pengenceran.
6. Pengenceran
diperhitungkan dalam rumus
tertentu.
Prosedur Pengenceran:
Haemasitometer, lalu lakukan
penghitungan jumlah sel dalam 5 kotak sedangdalam
1 kotak besar di tengah
Ø Penghitungan
dilakukan secara duplo
Ø Jumlah spora dalam 0,5 mL dalam 5 kotak
sedang dihitung dengan rumus:
S
Ʃn= n1+n2+n3+n4+n5 dimana:
n1 = rata-rata jumlah spora pada 16 kotak kecil pada kotak sedang 1
Aturan penghitungan sel
1. Karena
letak mikroorganisme hidup tidak teratur, maka dalam menghitung dibuat
kesepakatan agar sel yang terletak pada garis tidak dihitung dua kali.
2. Sel-sel
yang terletak pada garis sebelah kanan dan bawah tidak termasuk dalam persegi
kecil yang sedang dihitung selnya. Contoh pada persegi nomor 1 jumlah selnya
adalah 6.
3. Sel-sel
yang terletak pada garis sebelah kiri dan atas termasuk dalam persegi kecil
yang sedang dihitung selnya. Contoh pada persegi nomor 2 jumlah selnya adalah
3, pada persegi nomor 6 jumlah selnya 5.
Add caption |